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博濟(jì)醫(yī)藥科技股份有限公司
股票代碼為(300404)創(chuàng)建于2002年,2015年在深圳創(chuàng)業(yè)板上市,是一家為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)提供藥品、保健品、醫(yī)療器械研發(fā)與生產(chǎn)全流程“一站式”外包服務(wù)(CRO)的型高新技術(shù)企業(yè),同也提供藥品上市許可持有人(MAH)服務(wù)。
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藥品研發(fā)“一站式”服務(wù)包括:新藥立項(xiàng)研究和活性篩選、藥學(xué)研究(含中試生產(chǎn))、藥理毒理研究、臨床用藥與模擬劑的生產(chǎn)、臨床試驗(yàn)、臨床數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析、上市后再評(píng)價(jià)、技
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博濟(jì)醫(yī)藥始終堅(jiān)持“誠(chéng)實(shí)、守信、專業(yè)、權(quán)威”的經(jīng)營(yíng)理念,截至2020年,公司累計(jì)為客戶提供臨床研究服務(wù)800余項(xiàng),基本涵蓋了藥物治療的各個(gè)專業(yè)領(lǐng)域;累計(jì)完成臨床前研究服務(wù)500多項(xiàng)。經(jīng)過近二十年的發(fā)展,博濟(jì)醫(yī)藥在技術(shù)實(shí)力、服務(wù)質(zhì)量、服務(wù)范圍、營(yíng)業(yè)收入、團(tuán)隊(duì)建設(shè)等方面都已躋身我國(guó)CRO公司的領(lǐng)先位置,成為我國(guó)本土大型CRO公司的龍頭企業(yè)。
公司新聞
袁來如此|大分子生物分析概論(六)上:LBA定量抗體藥物的背景干擾及其消除
作者:廣州博濟(jì)醫(yī)藥 時(shí)間:2021-04-07 來源:廣州博濟(jì)醫(yī)藥

在臨床前和臨床研究中,LBA是用于定量分析抗體生物藥、抗藥物抗體和可溶性蛋白生物標(biāo)志物濃度的重要方法之一。但由于研究樣本主要由復(fù)雜的生物基質(zhì)組成,這些基質(zhì)可能表現(xiàn)出一定的干擾性,從而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量結(jié)果。本文將著重討論在藥物開發(fā)過程中如何緩解或消除對(duì)LBA定量分析方法干擾的策略,重點(diǎn)關(guān)注抗體生物藥的定量分析。


由于篇幅有限,本文將采用上下篇的形式來展開論述,敬請(qǐng)垂注!

1.導(dǎo)論

抗體生物藥在批準(zhǔn)上市的生物藥中占有很大的比例。


自1986年首次批準(zhǔn)鼠抗體Muronomab-CD3上市,到2013年通過Glyco工程人源化的obinutuzumab上市以來,共36個(gè)抗體藥物獲批用于治療人類疾病。開發(fā)抗體藥物的一個(gè)重要部分是分析藥物的藥(毒)代動(dòng)力學(xué)/(PK/TK),藥效動(dòng)力學(xué)(PD)和免疫原性(immunogenicity)表征。


動(dòng)物研究中的PK和PD數(shù)據(jù)可用于PK/PD建模,并指導(dǎo)人體首次劑量的選擇,隨后可以啟動(dòng)PK/PD迭代建模和仿真(simulation)的過程,從而完善從早期到晚期的臨床開發(fā)過程中的劑量選擇??煽康腜K和PD數(shù)據(jù)是成功地進(jìn)行 PK/PD 建模和仿真的先決條件,生物藥的免疫原性也能對(duì)其PK產(chǎn)生很大的影響,是臨床安全評(píng)估的重要組成部分。


此外,在臨床研究中準(zhǔn)確評(píng)估適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物可以為靶標(biāo)參與度、藥理機(jī)制證明和原理證明以及選擇最有可能對(duì)藥物作出響應(yīng)的患者群體提供有價(jià)值的信息。


免疫測(cè)試方法(Immunoassays)或更廣義地稱為配體結(jié)合式測(cè)試方法(ligand binding assays, LBA)是一種常用的分析方法,用于測(cè)定抗體藥物、抗藥物抗體(ADA)和可溶性蛋白生物標(biāo)志物(soluble protein biomarkers)。這些測(cè)試針對(duì)的生物樣本是復(fù)雜的基質(zhì),包含各種成分,其可以顯著地影響定量待測(cè)物的準(zhǔn)確性。對(duì)分析方法的干擾(interference)之前在文獻(xiàn)中討論過,但關(guān)注的重點(diǎn)是臨床化驗(yàn)室中所使用的化驗(yàn)方法,藥物開發(fā)過程中使用的許多檢測(cè)方法是定制開發(fā)的,對(duì)其表征也較少。


本文將側(cè)重于用于評(píng)估定量分析抗體生物藥濃度和ADA時(shí)遇到的干擾以及緩解干擾的策略。


2.什么是干擾

關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)

干擾測(cè)定值與實(shí)際值不同的現(xiàn)象。干擾可能來自物質(zhì)(substances)、測(cè)試程序、試劑和樣本的采集/處理。

相關(guān)文獻(xiàn)中之前提出干擾的定義是:樣品中存在的物質(zhì),其發(fā)揮影響或效應(yīng)改變了對(duì)一個(gè)待測(cè)物的正確的分析結(jié)果;該結(jié)果通常表達(dá)為待測(cè)物的濃度或活性數(shù)值。干擾可以區(qū)分為依賴于待測(cè)物的和不依賴于待測(cè)物的兩類。依賴于待測(cè)物的干擾包括直接影響對(duì)待測(cè)物的檢測(cè)(detection of the analyte)的所有因素。不依賴于待測(cè)物的干擾能夠在沒有待測(cè)物的情況下產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào),或直接抑制測(cè)試試劑。干擾導(dǎo)致結(jié)果的不真實(shí)可以是增加的或者減少的。

基質(zhì)干擾:導(dǎo)致測(cè)定的待測(cè)物濃度與其真實(shí)濃度不同的任何基質(zhì)成分,引起基質(zhì)干擾的物質(zhì)分子通常不得而知。

基質(zhì)干擾通常稱為非特異性。一個(gè)測(cè)試方法是被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)(detect)某個(gè)特定的待測(cè)物,基質(zhì)中任何能夠產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)或者抑制待測(cè)物信號(hào)的組成成分都可以定義為非特異性干擾。

然而,在對(duì)測(cè)試方法和待測(cè)物的生物學(xué)進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估之后,通常所觀察到的干擾并不令人驚訝,并且是由一個(gè)確定的生物分子引起的。因此,生物分析必須嚴(yán)格地審視現(xiàn)有的文獻(xiàn)以及之前的研究成果和試劑的特異性,以便相應(yīng)地確定該測(cè)試方法的特異性(specificity)。通常,干擾(Interference)和特異性是相關(guān)的, 一個(gè)擁有絕對(duì)特異性的測(cè)試方法不應(yīng)受到任何基質(zhì)干擾的影響。

但是,生物基質(zhì)較為復(fù)雜。即便對(duì)測(cè)試方法的系統(tǒng)和待測(cè)物的生物學(xué)有深度理解,也并不總是足以防止干擾的發(fā)生。與很少只檢測(cè)到單一條帶的western blots方法相似,大多數(shù)免疫測(cè)試方法(immunoassays)的特異性并不總是只針對(duì)一個(gè)待測(cè)物(圖1舉例說明了不同類型的干擾)。此外,干擾物質(zhì)的分子性質(zhì)是未知的,減少干擾最常用的方法是樣本稀釋。這種方法被廣泛地使用,以致于大多數(shù)分析科學(xué)家傾向于稀釋所有的樣本,而不相信未稀釋樣本的檢測(cè)結(jié)果。

一類值得特別注意的干擾物質(zhì)是樣本中的抗體。Heterophilic抗體一般具有廣泛的反應(yīng)性、低親和力、能交聯(lián)(crosslink)捕獲和檢測(cè)抗體,容易導(dǎo)致錯(cuò)誤的高信號(hào)結(jié)果。人抗動(dòng)物抗體被認(rèn)為具有較高的親和力,由于許多測(cè)試試劑含有來自小鼠的單克隆抗體,因此,人抗小鼠抗體是特別相關(guān)的一類干擾物質(zhì)。

當(dāng)今臨床上使用的測(cè)試方法仍然在某種程度上對(duì)heterophilic敏感,臨床醫(yī)生應(yīng)該考慮相關(guān)策略,以應(yīng)對(duì)免疫測(cè)試得出的不正確結(jié)果所造成的潛在損害。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor),即針對(duì)人類IgG的Fc區(qū)域的人類抗體,具有類似的效果,可以阻斷待測(cè)物與試劑的結(jié)合或交聯(lián)測(cè)試試劑,特別是當(dāng)試劑是人源的時(shí)候(例如,用抗體藥物作為測(cè)試試劑進(jìn)行ADA檢測(cè))。

干擾也可以來自于待測(cè)物或測(cè)試試劑的變化甚至降解,從而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)的降低。當(dāng)測(cè)試試劑可以結(jié)合到微孔板的表面或其它測(cè)試平臺(tái)上類似的表面的時(shí)候,會(huì)不真實(shí)地增加測(cè)試信號(hào)。最后,當(dāng)樣本的采集或處理過程引入了不反映所涉及生物體液中待測(cè)物濃度的額外待測(cè)物時(shí),待測(cè)物本身也就產(chǎn)生干擾(見圖1)。同樣,非常高濃度的待測(cè)物可以通過所謂的鉤狀效應(yīng)抑制測(cè)試信號(hào)。

圖1.免疫測(cè)試中的基質(zhì)干擾;HAMA:人抗鼠抗體; int.:干擾分子; RF:類風(fēng)濕因子



3.在方法開發(fā)和樣本分析中基質(zhì)干擾的表現(xiàn)

在支持臨床前和臨床研究的LBA方法中,可以在檢測(cè)研究樣本之前評(píng)估大多數(shù)的干擾。這種評(píng)估和減輕干擾的過程是定量分析方法開發(fā)的一個(gè)重要組成部分,通??梢酝ㄟ^一些簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來揭示干擾的存在。

平行性/線性和加標(biāo)樣品的回收率

通??梢酝ㄟ^測(cè)試樣品的連續(xù)稀釋來揭示干擾的存在。對(duì)不同程度的樣本稀釋,干擾很可能會(huì)導(dǎo)致所測(cè)定的濃度(dilution-adjusted concentration)的變化或不同。在大多數(shù)測(cè)試中,這種并行性的缺乏通常在較高的稀釋倍數(shù)下會(huì)消失,表明干擾是由一個(gè)基質(zhì)組分引起的。因此,如果在高濃度的情況下出現(xiàn)不平行性,干擾很可能是由于高濃度的干擾性基質(zhì)成分,能夠以高親和力結(jié)合待測(cè)物或測(cè)試試劑的基質(zhì)成分,或標(biāo)準(zhǔn)參考(比)物與內(nèi)源性待測(cè)物之間的差異引起的。

嚴(yán)格地說,后一種情況不是干擾,而是表明標(biāo)準(zhǔn)參考(比)物不適合用于定量?jī)?nèi)源性待測(cè)物。在這種情況下,測(cè)試方法只是準(zhǔn)(半)定量的。當(dāng)一定量的待測(cè)物加入到樣品中時(shí),不受干擾的分析方法應(yīng)該能夠?qū)尤肓窟M(jìn)行定量(回收率=100% + 誤差),基質(zhì)干擾往往會(huì)導(dǎo)致外加待測(cè)物的回收率降低,即<100%。如果內(nèi)源性待測(cè)物與添加的待測(cè)物的性質(zhì)不同,如重組蛋白vs內(nèi)源性蛋白,回收率本身只能作為干擾的一個(gè)指示。<>

阻斷干擾和特異性的相互作用

如果測(cè)試信號(hào)在添加阻斷試劑(例如阻斷緩沖液/ blocking buffers或heterophile阻斷試劑)后發(fā)生變化,則可能存在因測(cè)試試劑之間的相互作用或固體載體引起的基質(zhì)干擾。阻斷試劑與稀釋研究已被用于篩查干擾的類型,使用特異性試劑阻斷待測(cè)物可能會(huì)揭示非特異性信號(hào),因?yàn)樘禺愋宰钄嘣噭?yīng)該使得特異性信號(hào)的完全喪失。如果測(cè)試信號(hào)或一部分信號(hào)在使用阻斷試劑后仍然存在,這就意味著存在干擾。

研究結(jié)果評(píng)估

即使經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治龇椒ㄩ_發(fā),測(cè)試研究樣本時(shí)也會(huì)出現(xiàn)干擾,有時(shí)是因抗體藥物或聯(lián)合用藥導(dǎo)致的基質(zhì)變化所引起的。出現(xiàn)干擾的指示是測(cè)試結(jié)果與給藥后的預(yù)期效果不一致,特別是在研究的過程中,比較個(gè)體的PK,PD和免疫原性數(shù)據(jù)時(shí)。相關(guān)的檢測(cè)結(jié)果不一致也是存在干擾的一個(gè)重要指示,然而關(guān)于研究結(jié)果是否有效的結(jié)論則應(yīng)該謹(jǐn)慎,出乎預(yù)料的結(jié)果很有可能也是有效的。

下一節(jié)將討論在可溶性蛋白生物標(biāo)志物,抗體藥物和ADA測(cè)試中觀察到的干擾。

4.可溶性蛋白生物標(biāo)記物

可溶性蛋白生物標(biāo)記物的定量分析已成為藥物開發(fā)的基石,并為藥物開發(fā)過程中的安全性、有效性、PD和作用機(jī)制的評(píng)估提供重要信息。血液循環(huán)或尿液中的可溶性蛋白質(zhì)樣本很容易獲得,在臨床上作為常規(guī)的診斷性測(cè)試(diagnostic assays)使用,或用于預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的反應(yīng)。在這個(gè)領(lǐng)域中,診斷測(cè)試中存在干擾是公認(rèn)的,因此完全依賴某一個(gè)測(cè)試結(jié)果可能導(dǎo)致誤診。

一個(gè)明顯的例子是在診斷性人絨毛膜促性腺激素檢測(cè)(diagnostic human chorionic gonadotropin assay)中,最可能由heterophilic抗體干擾引起的假陽(yáng)性結(jié)果導(dǎo)致了不必要的,包括外科手術(shù)和化療的治療性干預(yù)。用于支持測(cè)試方法開發(fā)的研究的聚焦點(diǎn)(focus)和深度(depth),取決于該方法的預(yù)期目的,因而出現(xiàn)“符合其用途(fit-for-purpose)的方法開發(fā)”這個(gè)術(shù)語(yǔ)。

關(guān)于生物標(biāo)志物的分析方法開發(fā)和驗(yàn)證,通用指南的發(fā)布極大地推進(jìn)了生物標(biāo)志物檢測(cè)的方法開發(fā)和驗(yàn)證的實(shí)踐。本文關(guān)注的焦點(diǎn)在于測(cè)試方法對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾。

樣本采集和處理

從血細(xì)胞中非特異性地釋放待測(cè)物可能發(fā)生在涉及血液基質(zhì)的樣品采集或處理過程中,如果可溶性蛋白生物標(biāo)志物出現(xiàn)這種情況,就會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物濃度的假性升高以及測(cè)試結(jié)果的變異性增加。例如,在測(cè)定PDGF或VEGF等生長(zhǎng)因子時(shí),應(yīng)注意選擇最合適的樣本類型,以避免樣本的處理過程非特異性地激活血小板并釋放蛋白質(zhì)進(jìn)入到樣本中。對(duì)于這些待測(cè)物,血漿是比血清更合適的樣本基質(zhì)。

有研究表明,在分析前樣本的處理過程中,室溫保存會(huì)顯著改變血液樣本中IL-8的濃度。室溫孵育會(huì)產(chǎn)生更多的IL-8,導(dǎo)致血液裂解液(blood lysate)樣本中IL-8的濃度不真實(shí)地增加。采集后立即將樣品保存在冰上,而不是室溫下,可以減少這種影響。紅細(xì)胞部分溶解(溶血hemolysis)的血清或血漿樣本并不少見,如果紅細(xì)胞含有高濃度的待測(cè)物的話(例如,aspartate transaminase),則會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物的錯(cuò)誤數(shù)值。

蛋白質(zhì)的構(gòu)象可以影響檢測(cè)試劑的檢測(cè)能力,這可能由測(cè)試緩沖液中的成分引起。例如,血漿中鈣的螯合作用已被證明會(huì)影響對(duì)鈣結(jié)合蛋白S100A12的檢測(cè)。這樣的干擾可以通過使用不依賴于陽(yáng)離子結(jié)合而能檢測(cè)待測(cè)物的檢測(cè)試劑,或在樣本中加入陽(yáng)離子,或選擇不引起金屬螯合的樣本制備方法(例如肝素鈉血漿或血清)來減輕。

在某些情況下,樣本的物理特性會(huì)使移液變得困難,這種情況或?qū)⒃跍y(cè)試過程中引入干擾。例如,痰的粘度很高,以至于不能實(shí)現(xiàn)精確的移液。通過對(duì)常規(guī)的痰液采用黏液溶解劑dithiothreitol處理,可以降低總粘度;同時(shí),還必須考慮dithiothreitol的濃度及其對(duì)免疫測(cè)試試劑和待測(cè)物完整性的潛在影響。

此外,一些血漿或尿液樣本中不溶性沉淀物引起的高渾濁度會(huì)引入干擾或高背景信號(hào),可以通過離心或過濾來減少沉淀物,諸如此類的方法可以減少基質(zhì)干擾,并盡量減少由機(jī)械性錯(cuò)誤引起的誤差。

特異性

如上所述,對(duì)分析方法特異性的錯(cuò)誤解釋是基質(zhì)干擾的主要原因。一個(gè)可溶性蛋白生物標(biāo)志物可能有不同的高度同源的家族成員,異構(gòu)體或前體蛋白(precursor proteins)。如果一個(gè)結(jié)構(gòu)上與實(shí)際待測(cè)物相關(guān)的蛋白質(zhì),而且免疫分析系統(tǒng)中的捕獲試劑和檢測(cè)試劑都能識(shí)別,那它就會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白生物標(biāo)志物出現(xiàn)錯(cuò)誤的高濃度結(jié)果(例如,一種商用的PDGF-BB測(cè)試方法也檢測(cè)到10%的PDGF-AB)。

Periostin是嗜酸性氣道炎癥的生物標(biāo)志物,具有多種亞型;在分析方法的開發(fā)過程中,明確定義了該方法對(duì)于這些異構(gòu)體的特異性。一些用于medullary thyroid carcinoma診斷的calcitonin分析方法,似乎也部分檢測(cè)到了pro-calcitonin,但后者對(duì)于medullary thyroid carcinoma沒有診斷價(jià)值。

如果只有捕獲試劑(或均相分析中的檢測(cè)試劑)與待測(cè)物相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合,則可能導(dǎo)致待測(cè)物的錯(cuò)誤的低測(cè)定值。可以通過了解相關(guān)生物系統(tǒng)來理解和管理這樣的干擾。例如:確定潛在的交叉反應(yīng)因子及其相對(duì)濃度和親和性、選擇對(duì)待測(cè)物盡可能特異性的試劑、稀釋樣品(其可能將相關(guān)干擾蛋白的濃度降低到測(cè)試方法的檢出限以下)。

另一種可能的方法是通過添加一種特定的試劑來消耗或中和系統(tǒng)中的干擾異構(gòu)體或家族成員蛋白,這種試劑只壓制(suppression)相關(guān)蛋白,而不壓制待測(cè)物本身。

結(jié)合蛋白

可溶性受體或其它直接與待測(cè)物結(jié)合的蛋白質(zhì)的存在可能導(dǎo)致分析信號(hào)的改變,因?yàn)樗鼈兛赡茉贚BA測(cè)試中,阻斷或加強(qiáng)與捕獲或檢測(cè)試劑的相互作用。例如,IL-6可與IL-6R和gp130形成復(fù)合物,可根據(jù)檢測(cè)試劑的不同,可以檢測(cè)到不同性質(zhì)的IL-6。通過選擇測(cè)試試劑,其結(jié)合待測(cè)物,但不與樣本中干擾蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn),則可以減少可溶性受體或結(jié)合蛋白引起的干擾,特別是當(dāng)引起干擾的相互作用的親和力低時(shí),稀釋可以減少干擾。如果不可行,其他可能的方法涉及破壞待測(cè)物和結(jié)合蛋白或可溶性受體之間的結(jié)合。例如,酸解離可以從類胰島素生長(zhǎng)因子與其結(jié)合蛋白的復(fù)合物中解離出類胰島素生長(zhǎng)因子,在中和樣本之前加入結(jié)合蛋白的抑制劑可以進(jìn)一步減少干擾。

對(duì)此類樣本預(yù)處理,應(yīng)嚴(yán)格評(píng)估其對(duì)測(cè)試試劑或待測(cè)物表位的影響。由于此類基質(zhì)干擾可能難以完全消除,因此,最重要的是了解測(cè)試試劑的特異性以及檢測(cè)到的待測(cè)物的各種復(fù)合物,以便據(jù)此解釋測(cè)試結(jié)果。

內(nèi)源性抗體

如前所述,heterophilic抗體和抗動(dòng)物抗體可以結(jié)合主要是動(dòng)物來源的抗體測(cè)試試劑;從而導(dǎo)致不真實(shí)的高或低結(jié)果。人抗小鼠抗體是最常見的人抗動(dòng)物抗體類型,可以結(jié)合夾心式LBA方法中的捕獲和/或檢測(cè)試劑(取決于產(chǎn)生試劑的物種)。與這兩種試劑結(jié)合會(huì)導(dǎo)致試劑橋接和特定待測(cè)物的假陽(yáng)性結(jié)果;與其中的一種結(jié)合,則可能會(huì)破壞待測(cè)物的結(jié)合并導(dǎo)致假陰性結(jié)果。減少heterophilic抗體或人抗動(dòng)物抗體干擾的最常見方法是添加動(dòng)物免疫球蛋白(純化或來自正常動(dòng)物血清中的)或其他商用試劑(例如heterophile的阻斷劑),這些試劑對(duì)heterophilic抗體具有特異的活性。

此外,對(duì)蛋白質(zhì)生物標(biāo)記的抗體(自體抗體autoantibodies)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的低或高信號(hào)。例如,針對(duì)thyroxine的自體抗體,存在于Hashimoto’s thyroiditis等疾病中,并在一個(gè)thyroxine競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試方法中與fluorescein-T4示蹤劑結(jié)合,導(dǎo)致thyroxine測(cè)定值偏低。

均相的測(cè)定方法(homogenous assays)可能比sequential assays更容易受到這種干擾。選擇來自兩個(gè)不同物種的試劑來捕獲和檢測(cè)待測(cè)物,也可能有助于減少人抗動(dòng)物抗體的橋接干擾。另一種方法是對(duì)樣本進(jìn)行足夠的稀釋以消除干擾。使用G蛋白去除干擾抗體,或使用detergent破壞嗜異性抗體的相互作用。這些和其它改變樣本的處理可能會(huì)產(chǎn)生問題,因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)意外地移除待測(cè)物或影響測(cè)試試劑。

其它樣品成分

歷史上,測(cè)定吸光度或光散射的臨床測(cè)試方法受高脂(脂血癥lipidemia)或膽紅素(黃疸icterus)樣本的影響,而LBA方法則不受影響。然而,膽紅素降低了一個(gè)檢測(cè)b型人絨毛膜促性腺激素和IgG的商業(yè)化的檢測(cè)方法所測(cè)定的數(shù)值,干擾可能來自預(yù)料之外的地方。

例如,胰腺囊腫液中的蛋白酶可以降解待測(cè)物和試劑抗體,蛋白酶也被懷疑干擾了痰標(biāo)本中IL-5的檢測(cè),因?yàn)樘砑拥鞍酌敢种苿┰黾恿薎L-5的檢測(cè)數(shù)值。有趣的是,在使用治療劑量后,發(fā)現(xiàn)樣本中的biotin對(duì)幾個(gè)測(cè)試方法產(chǎn)生了巨量干擾。


5.游離的可溶性靶標(biāo)&可溶性靶標(biāo)總量分析

游離和總體靶標(biāo)分析是針對(duì)可溶性抗原抗體藥物最常用的靶標(biāo)結(jié)合生物標(biāo)志物。如果一個(gè)靶標(biāo)的可溶性形式進(jìn)入血液,或者膜結(jié)合靶標(biāo)的可溶性異構(gòu)體可能存在于血液循環(huán)中,則游離和總體靶標(biāo)分析數(shù)據(jù)也可作為針對(duì)膜抗原抗體的替代靶標(biāo)結(jié)合生物標(biāo)志物。

抗體藥物對(duì)游離的靶標(biāo)的壓制(suppression)是衡量靶標(biāo)結(jié)合效的直接表現(xiàn)。使用抗體藥物治療后,由于與抗體藥物結(jié)合后靶標(biāo)清除率降低,總體靶標(biāo)通常在血液循環(huán)系統(tǒng)中累積。由于靶標(biāo)結(jié)合與其清除率之間的這種關(guān)系,靶標(biāo)總數(shù)間接地說明了靶標(biāo)的結(jié)合程度。此外,從總體靶標(biāo)累積的數(shù)據(jù),可以通過PK/PD模擬對(duì)游離靶標(biāo)的壓制。定量分析游離和總體靶標(biāo),除了面臨所有對(duì)可溶性蛋白生物標(biāo)志物的挑戰(zhàn)外,還面臨獨(dú)特的挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)

游離可溶性靶標(biāo)的定量方法:衡量靶標(biāo)參與度的測(cè)試方法。由于游離的藥物和與藥物靶標(biāo)結(jié)合的藥物之間的動(dòng)態(tài)平衡在樣本孵育過程中發(fā)生變化,這種測(cè)定方法尤其受到檢測(cè)程序本身的干擾。

游離可溶性靶標(biāo)的分析方法

大多數(shù)測(cè)定游離可溶性靶點(diǎn)的方法都是基于捕獲試劑與抗體藥物競(jìng)爭(zhēng)與靶點(diǎn)結(jié)合的原理。測(cè)試方法的特異性和對(duì)靶標(biāo)生物學(xué)的理解是建立可靠的游離靶標(biāo)分析方法的關(guān)鍵。預(yù)期對(duì)這類方法的干擾與先前討論的生物標(biāo)志物方法相同。此外,游離靶標(biāo)的定量還會(huì)受到與方法的特異性,樣本稀釋,抗體藥物/靶標(biāo)復(fù)合物的無(wú)意解離、孵育時(shí)間和捕獲試劑的濃度相關(guān)的干擾。

對(duì)游離靶標(biāo)的定量分析中,靶標(biāo)可能不僅與抗體藥物結(jié)合,而且還與內(nèi)源的可溶性受體或結(jié)合蛋白相互作用。在某些情況下,它們與靶標(biāo)結(jié)合的親和力與抗體藥物相當(dāng)。此外,靶標(biāo)蛋白的不同亞型不一定與抗體藥物結(jié)合,因而不一定被被檢測(cè)到。

確認(rèn)一個(gè)方法能檢測(cè)到的靶標(biāo)組分(fraction of target)是至關(guān)重要的。它既可以是未結(jié)合抗體藥物的組分(therapeutic antibody-unbound fraction),也可以是未結(jié)合抗體藥物和結(jié)合蛋白的組分(the binding protein- and therapeutic antibody-unbound fraction)。在這兩種情況下,可能有必要在研究期間評(píng)估結(jié)合蛋白水平的變化,以適當(dāng)?shù)亟忉寯?shù)據(jù)。此外,了解結(jié)合蛋白是否抑制靶標(biāo)蛋白以及結(jié)合蛋白是否與藥物抗體競(jìng)爭(zhēng)與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合,也是至關(guān)重要的,由于一些靶標(biāo)擁有多個(gè)結(jié)合蛋白,因此應(yīng)該將體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)放在對(duì)游離靶標(biāo)結(jié)果有影響的結(jié)合蛋白上。

許多LBA方法依靠稀釋樣本來減少未知來源的基質(zhì)干擾。在游離靶標(biāo)的分析中,稀釋樣本改變了游離靶標(biāo)與藥物結(jié)合的靶標(biāo)以及與血液循環(huán)中結(jié)合蛋白或可溶性受體結(jié)合的靶標(biāo)之間的動(dòng)態(tài)平衡。此問題有兩種解決方案:1.開發(fā)不需要稀釋樣本的分析方法; 2.稀釋樣本并恰當(dāng)?shù)貓?bào)告結(jié)果。如果可行,始終優(yōu)先考慮在未稀釋的樣本中定量分析游離的靶標(biāo)。

在未稀釋的樣本中消除基質(zhì)干擾是一項(xiàng)困難的工作,因?yàn)樯锘|(zhì)是復(fù)雜的,并且在血漿和血清中總蛋白濃度很高。測(cè)量未稀釋樣本的一種方法是使用與樣本基質(zhì)相似的緩沖液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,這將導(dǎo)致對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本相同的基質(zhì)效應(yīng),因此測(cè)試結(jié)果不會(huì)受基質(zhì)的影響。這個(gè)方法只有在單個(gè)樣本之間的基質(zhì)干擾相對(duì)穩(wěn)定的情況下才會(huì)有效,生成這種測(cè)試基質(zhì)最準(zhǔn)確的方法是將所有待測(cè)物消耗掉,并避免depleting reagent進(jìn)入樣本基質(zhì)。使用來自其它物種的血清或血漿(例如,胎牛血清)通常是足夠的,因?yàn)樗鼈儾慌c捕獲試劑結(jié)合,或者在均相分析中也不與檢測(cè)試劑結(jié)合。從操作的角度來看,未稀釋的血清或血漿樣品是粘稠的,在移液和稀釋過程中需要格外小心,以確保測(cè)試的準(zhǔn)確度和精密度。

從稀釋的樣本中準(zhǔn)確地得出游離待測(cè)物的濃度也具有一定的可能性。在一個(gè)雙組分系統(tǒng)中,抗體藥物和親和力與豐度是已知的,因此可以預(yù)估對(duì)稀釋樣本中待測(cè)物濃度的影響。對(duì)于平衡擾動(dòng)對(duì)測(cè)定游離激素的影響有詳細(xì)的研究。圖2顯示了一個(gè)簡(jiǎn)單的、在不同的靶標(biāo)/抗體藥物比值下樣本稀釋的模擬。對(duì)于親和力為0.1nM的典型抗體,靶標(biāo)濃度為5 nM,對(duì)于靶標(biāo)/抗體藥物結(jié)合位點(diǎn)(CDR互補(bǔ)性確定區(qū)域)比例為1:3或更高的情況,未經(jīng)稀釋調(diào)整的濃度是相當(dāng)準(zhǔn)確的。對(duì)于CDR與靶標(biāo)濃度比值較高的樣本,較高的稀釋度對(duì)未調(diào)整稀釋的濃度(non-dilution-adjusted concentration)的影響不大。也可以通過模擬不同體內(nèi)情況下的體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證數(shù)據(jù)報(bào)告的策略。對(duì)于在藥物wash-out period結(jié)束時(shí)收集的樣本,即當(dāng)抗體藥物和靶標(biāo)濃度趨于一致時(shí),報(bào)告未稀釋調(diào)整的數(shù)據(jù)將是不準(zhǔn)確。在上面的例子中,當(dāng)CDR與靶標(biāo)的摩爾比值為1:1時(shí),未經(jīng)稀釋調(diào)整的數(shù)據(jù)是不準(zhǔn)確的。在相關(guān)研究中,必須定義一個(gè)客觀標(biāo)準(zhǔn),只在合適的時(shí)間點(diǎn)報(bào)告未經(jīng)稀釋調(diào)整的濃度數(shù)據(jù)。

圖2. 在不同靶標(biāo)-抗體濃度比值下,樣本稀釋對(duì)游離靶標(biāo)的濃度的影響。假設(shè):解離常數(shù)(KD)= 0.1 nM;樣本中的待測(cè)物濃度為5 nM;抗體藥物的CDR是1-,3-,10-,30-或100-倍于靶標(biāo)的摩爾濃度

此外,測(cè)試試劑會(huì)引入一個(gè)誤差,因?yàn)榻Y(jié)合的和游離的靶標(biāo)之間的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)發(fā)生漂移(當(dāng)存在額外的結(jié)合試劑,即捕獲試劑的時(shí)候)。這種所謂的觀察者效應(yīng)(observer effect)解釋了一個(gè)物理原理:觀察的行為會(huì)改變被觀察的現(xiàn)象。

雖然這一原理與可溶性蛋白生物標(biāo)志物的定量分析幾乎無(wú)關(guān);然而,這一原理卻非常適用于游離靶標(biāo)的定量分析,在總體靶標(biāo)濃度高、游離靶標(biāo)濃度低的樣本中體現(xiàn)得尤其如此。在抗體藥物給藥后,由于與抗體結(jié)合后靶標(biāo)的系統(tǒng)清除率降低,總體靶標(biāo)常在血液循環(huán)系統(tǒng)中累積。

對(duì)游離靶標(biāo)最佳的定量分析方法應(yīng)該使用最少量的捕獲試劑和較短的孵育時(shí)間,以最小化對(duì)平衡的干擾。然而,這種方法降低了測(cè)試方法的精密度、穩(wěn)健性和線性范圍。因此,最好研究觀察者效應(yīng)的程度,并在游離靶標(biāo)分析的準(zhǔn)確度和實(shí)用性之間找到一個(gè)平衡。

如果捕獲試劑與抗體藥物相同或非常相似,ADA就會(huì)干擾游離靶標(biāo)的定量。在這種情況下,ADA不僅與抗體藥物結(jié)合,而且還結(jié)合并阻斷捕獲試劑,因此很少或沒有游離靶標(biāo)能與捕獲試劑結(jié)合,導(dǎo)致游離靶標(biāo)的濃度大幅降低。這一效應(yīng)可能導(dǎo)致即使在沒有抗體藥物的情況下,靶標(biāo)也被壓制的假象,有鑒于此,應(yīng)當(dāng)避免將抗體藥物作為捕獲試劑使用。

在藥物開發(fā)早期,可能沒有合適的試劑。如果抗體藥物的免疫原性非常低,或者是單劑量給藥的研究,在免疫系統(tǒng)開始產(chǎn)生ADA之前抗體藥物就被清除了,則可以將抗體藥物作為捕獲試劑。亦可將ADA為陽(yáng)性的個(gè)人的游離靶標(biāo)數(shù)據(jù)排除在最終的數(shù)據(jù)分析之外。此外,在臨床前研究中,可以從樣本中剔除包括潛在的ADA在內(nèi)的動(dòng)物抗體。

可溶性靶標(biāo)總量的分析方法

抗體藥物經(jīng)常干擾可溶性靶標(biāo)總量的測(cè)定。即使捕獲和檢測(cè)抗體的表位與抗體藥物的表位都不重疊,仍然經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)干擾??贵w藥物可能改變靶標(biāo)的構(gòu)象或與兩個(gè)靶標(biāo)分子交聯(lián)(crosslink),導(dǎo)致靶標(biāo)總量的高估或低估。為了規(guī)避這一效應(yīng),可以在樣本中加入過量的抗體藥物,將所有游離的可溶性靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為藥物-靶標(biāo)復(fù)合物。添加過量的抗體藥物后,就可以使用針對(duì)靶標(biāo)-藥物復(fù)合物的定量分析系統(tǒng)來測(cè)定靶標(biāo)總量。在這種情況下,ADA可能結(jié)合抗體藥物造成干擾,可通過形成多聚體復(fù)合物(multimeric complexes)來阻斷檢測(cè)(inhibit detection)或放大特定的檢測(cè)信號(hào)。

Salimi-Moosavi等人證明,研究樣本的堿性或酸性/guanidine 處理均可將抗體藥物產(chǎn)生不可逆變性,而靶標(biāo)在樣本中和后,則可恢復(fù)免疫反應(yīng)性。這樣的預(yù)處理能有效地消除抗體藥物的所有干擾(這種方法能廣泛應(yīng)用于其他蛋白靶標(biāo)和抗體藥物,那將會(huì)很有意義)。

另一種方法是將僅使用一種非競(jìng)爭(zhēng)性抗體和治療性抗體作為試劑,使用非競(jìng)爭(zhēng)性抗體捕獲靶點(diǎn)游離或結(jié)合在治療性抗體上。靶標(biāo)和治療性抗體,然后篩選了酸、中和和涂布到聚苯乙烯板上。進(jìn)而用標(biāo)記的治療性抗體檢測(cè)被包裹的靶點(diǎn)。

特別聲明

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