上周，“袁來如此”專欄正式開篇，博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士以《大分子生物分析概論（一）：大分子藥物生物分析的基礎(chǔ)知識》為題，梳理了大分子藥物分析方法的基礎(chǔ)概念。
本期開始，“袁來如此”專欄將就LBA定量方法的監(jiān)管驗證展開詳細(xì)介紹，預(yù)計將有多篇重磅干貨內(nèi)容呈現(xiàn)，敬請垂注！
1992年，美國弗吉尼亞州水晶城，全球首個關(guān)于生物分析方法驗證會議召開，會議討論共識的生物利用度、生物等效性和藥代動力學(xué)研究的生物分析方法成為了后來制藥行業(yè)進(jìn)行生物分析方法驗證的實際準(zhǔn)則。史稱水晶城會議。
水晶城會議還討論了生物分析方法驗證的普遍問題，同時也承認(rèn)了色譜和非色譜測試方法（包括免疫測試方法和微生物方法）之間存在差異。以水晶城會議為基礎(chǔ)，后續(xù)的行業(yè)會議和文獻(xiàn)對生物分析方法驗證進(jìn)行了多次討論。
迄今為止，人們最重視的是常規(guī)小分子藥物的生物分析方法的驗證，其主要原因是自從1990年以來，作為小分子藥物的常規(guī)分析工具——串聯(lián)式液相色譜-質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）的使用率在迅速地增長。而大分子的生物分析方法亦對此借鑒頗多。
在本文中，LBA 是免疫測試方法（immunoassays）的同義詞，指任何基于大分子相互作用進(jìn)行定量分析的方法；監(jiān)管驗證（regulatory validation）則是通過驗證后方法所產(chǎn)生的分析數(shù)據(jù)，可供生物藥物的臨床前毒理研究和臨床申報、注冊使用。后續(xù)文章將詳細(xì)解釋監(jiān)管驗證與非監(jiān)管驗證之間的差異，敬請關(guān)注。
一個分析方法的生命周期通?？煞譃?個階段：方法開發(fā)（method development）、研究前驗證（pre-study validation）和研究中驗證（in-study validation）。方法開發(fā)是建立分析方法的過程，而研究前驗證是對分析方法的確認(rèn)，研究中驗證則是在應(yīng)用過程中，如出現(xiàn)關(guān)鍵成分發(fā)生變化后，進(jìn)行的部分驗證。
為了確保一個分析方法能用于大分子定量，以支持藥代動力學(xué)評估，并經(jīng)得起監(jiān)管審核，需要對特定分析方法的各個組成部分進(jìn)行評估、驗證和持續(xù)監(jiān)控。因此，只要使用該分析方法，其驗證就是一個持續(xù)的過程。
所以，方法驗證是一個動態(tài)的過程。表1總結(jié)了需要評估的組分和對于分析方法生命周期中每個階段的建議。本文的組織也對應(yīng)于這些方法組分，在相應(yīng)的章節(jié)中，將討論在不同階段中可能開展的活動的更完整、詳信的信息。
方法開發(fā)階段
在方法開發(fā)過程中生成的信息應(yīng)記錄在實驗室筆記本或其他可接受的文檔形式中。應(yīng)包括以下評估信息：關(guān)鍵檢測試劑的選擇和穩(wěn)定性、測試格式的選擇（抗體、稀釋液、微孔板、檢測系統(tǒng)等）、標(biāo)準(zhǔn)曲線模型的選擇、樣本基質(zhì)的選擇、試劑的特異性、樣本制備、初步的穩(wěn)定性研究和方法穩(wěn)健性（robustness）的初步評估。在方法開發(fā)階段結(jié)束時，應(yīng)生成方法草案或方法驗證工作列表（即需要進(jìn)行的實驗），供研究前驗證期間參考。
研究前驗證階段
在開始研究前驗證的實驗之前，應(yīng)撰寫一個方法驗證計劃或者是可以參考適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOP），以確保研究前驗證所需要做的實驗有一個書面大綱。此驗證計劃可以是一個獨立的文檔，也可以是實驗室記錄本或類似文檔的一部分。該文件應(yīng)包括對此方法預(yù)期用途的描述以及需要驗證的性能參數(shù)，這些參數(shù)包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確性、定量范圍、特異性和選擇性、穩(wěn)定性、稀釋線性、穩(wěn)健性、運行大?。ㄅ蝏atch/run size）和運行接受標(biāo)準(zhǔn)。該驗證計劃應(yīng)包括擬進(jìn)行的實驗工作所研究的每個性能參數(shù)的目標(biāo)接受標(biāo)準(zhǔn)。完成驗證實驗后，應(yīng)撰寫一份全面的報告，報告的格式可以由實驗室的內(nèi)部政策決定，此報告應(yīng)匯總測試性能數(shù)據(jù)、涉及方法SOP或驗證計劃的偏差以及任何其他相關(guān)信息。研究中驗證階段
在實驗過程中，研究人員需要生成包含適當(dāng)統(tǒng)計參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制樣品（QC）的累積數(shù)據(jù)匯總表，并將其與研究樣本的測定數(shù)值匯總到最終的研究報告中。與研究前驗證不同的是，這些表格中不包括失敗的運行。最終報告中需包含的其他信息包括：分析過程中發(fā)生的偏差描述、重復(fù)分析的樣本匯總及其原因以及所有未通過運行的詳細(xì)信息的匯總表。4.測試試劑的選擇、穩(wěn)定性、測試格式和運行/批次大?。╞atch/run size)LBA分析方法的關(guān)鍵組成部分是配體試劑（ligand reagent），通常是用于免疫測試的一個或一對抗體。此外，其他配體試劑還可能包括結(jié)合蛋白（binding protein）、受體（receptor）、寡核苷酸（oligonucleotide）和多肽片段。為簡單起見，本文僅討論免疫測試用的試劑（必須選擇擁有適當(dāng)特異性和選擇性試劑，其應(yīng)當(dāng)具有能夠持久且穩(wěn)定地形成抗體/抗原復(fù)合物的結(jié)合特性）。LBA的測試格式包括但不限于：夾心式、競爭式、直接或間接結(jié)合抑制以及固相或溶液相的測試格式。一個典型的測試運行（batch/run）包含了標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)樣品（standard calibrator）、驗證樣品（validation sample）、QC 樣品和研究樣本（study sample），在應(yīng)用要驗證的方法時須將它們作為整體進(jìn)行分析。在理想狀況下，所需最低數(shù)量的QC樣品應(yīng)代表給定運行中研究樣本總數(shù)的5%。對于基于微孔板的測試方法，一個運行可以包括多個獨立的微孔板，但每個微孔板應(yīng)包含獨立的一組校準(zhǔn)樣品和QC樣品。
方法開發(fā)階段
方法開發(fā)的第一步是選擇測試格式。對于固相測試，必須選擇固定抗體或其他蛋白質(zhì)。如受體的固相，常為塑料和玻璃表面，但二者之間的差異可能很大，還會影響方法的靈敏度和變異性。如果使用主動吸附（active adsorption，例如avidin-biotin），則必須選擇用于改變固相表面（包板）的合適的化學(xué)反應(yīng)。被動吸附（passive adsorption）是最常用的包板方法，但會受到所使用的緩沖液特性（例如鹽濃度和pH）的影響，必須適當(dāng)?shù)剡x擇包板溶液的濃度/體積、混合蛋白質(zhì)的模式（搖動與渦旋）和包板的溫度。在選擇測試稀釋液時，必須考慮待測物、預(yù)期的基質(zhì)和結(jié)合實體（例如抗體或受體）的具體特征。例如，可能需要添加重金屬或螯合劑，以便確認(rèn)達(dá)到最佳的結(jié)合狀態(tài)。此外，還可能需要考慮去污劑（例如，Tween-20或Triton-X100）或填充蛋白（如albumin,casein或gelatin），從而優(yōu)化測試方法的性能。
實驗過程中應(yīng)當(dāng)選擇合適的信號檢測系統(tǒng)，以提供可接受的信號并使背景噪聲最小化。使用比色法（colorimetry）以外的信號檢測系統(tǒng)，可以提高檢測的靈敏度。這些檢測信號系統(tǒng)包括熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性測定和電化學(xué)發(fā)光。使用信號放大系統(tǒng)可以實現(xiàn)更高的靈敏度。除了分析方法的各個組分外，在方法開發(fā)過程中，還應(yīng)當(dāng)選擇、建立和運行該分析方法的格式，如競爭式或非競爭式。
應(yīng)當(dāng)建立分析配置（assay configuration，例如標(biāo)準(zhǔn)品、QC樣品和研究樣本在微孔板上的位置），并測試與預(yù)期的研究中測試運行相同數(shù)量的微孔板。應(yīng)當(dāng)根據(jù)測試方法的性能與所需的測試精密度之間的關(guān)系來確定用于標(biāo)準(zhǔn)品、QC樣品和研究樣本的重復(fù)孔數(shù)量。雖然最終結(jié)果可以基于單孔或復(fù)孔的分析結(jié)果，但確定QC樣品結(jié)果的重復(fù)孔數(shù)量必須與用于獲取真實樣本結(jié)果的重復(fù)孔數(shù)量相同。
對運行內(nèi)（intra-batch/run）和運行間（inter-batch/run）測試性能的評估，需要為每個驗證樣本生成多個結(jié)果，其中每個結(jié)果都是根據(jù)重復(fù)孔的響應(yīng)值計算的。測試運行的數(shù)量和每個樣本的重復(fù)孔結(jié)果（即重復(fù)測量結(jié)果）的數(shù)量應(yīng)足夠大，從而可靠地估計該測試方法的性能特征。稍后在涉及特定性能特征（例如，精密度和準(zhǔn)確性）的部分中，將提出有關(guān)最少測試運行/重復(fù)孔數(shù)量的建議。
研究前驗證階段
在方法驗證時，應(yīng)當(dāng)使用在方法開發(fā)階段識別和優(yōu)化了的關(guān)鍵測試試劑（簡稱關(guān)鍵試劑），且不能更改，并在方法SOP中予以標(biāo)識。在方法驗證的過程中，將確認(rèn)方法草案中定義的這些關(guān)鍵試劑的性能。還應(yīng)當(dāng)確認(rèn)分析配置（如微孔板數(shù)量、標(biāo)準(zhǔn)品和驗證樣品的位置、重復(fù)孔數(shù)量、操作條件等）以及在方法開發(fā)過程中確定的測試運行的大小（batch/run size）。研究中驗證階段
在測試方法的生命周期中，通常需要更換某個關(guān)鍵組分（例如試劑批次）。對已驗證組分的更改，需要進(jìn)行部分驗證，來證明其具有類似的性能。此外，還可以使用在常規(guī)分析運行中QC樣品產(chǎn)生的可接受結(jié)果，來延長關(guān)鍵試劑（不包括參考標(biāo)準(zhǔn)，reference standard）的有效期，并且必須根據(jù)這些數(shù)據(jù)，仔細(xì)記錄有效期的延長。在研究中驗證時，應(yīng)當(dāng)使用之前驗證過的測試格式，對此格式的任何更改均應(yīng)清晰地記錄在案。如果進(jìn)行了重大更改，則可能需要進(jìn)行部分驗證，以證明測試性能的可比性。5.參照（比）物（REFERENCE MATERIAL)用于制備標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品（standard calibrator）、驗證樣品和QC樣品的物料來源會有所不同。須著重了解物料的來源及相關(guān)說明材料。在條件允許的情況下，盡可能地將標(biāo)準(zhǔn)品、驗證樣品、QC樣品等從同一來源物料的單獨分裝（separate aliquot）小份中制備。參照（比）物在供應(yīng)有限的情況下（例如，藥物相互作用研究，其中純標(biāo)準(zhǔn)品只能從商業(yè)試劑盒這樣的有限來源獲得），可以通過考查不同批次或其他商業(yè)商品之間的可比性后，從同一個單個等分（single aliquot）物料中制備標(biāo)準(zhǔn)品和QC樣品。6.特異性（specificity)和選擇性（selectivity）抗體的特異性（specificity）是指其結(jié)合目標(biāo)抗原的能力。在理想的情況下，所使用的抗體對待測物是特異性的，即不與樣品中可能存在的待測物的變異體，或其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)。特異性有時與交叉反應(yīng)性的概念有關(guān)，如果抗體是高度特異性的，則其交叉反應(yīng)性較低。
選擇性（selectivity）是一個與特異性有關(guān)的概念，是一種分析方法在樣本中存在其他成分的情況下檢測待測物的能力。通常，LBA無需樣品預(yù)處理（例如萃?。?，可直接在生物基質(zhì)中測定待測物的濃度，但此做法或?qū)⑹艿皆噭┡c樣本基質(zhì)成分的交叉反應(yīng)所引起的非特異性反應(yīng)的影響。特異性和選擇性評估將驗證該分析方法是否對待測物具有特異性，并且可以從復(fù)雜的基質(zhì)中選擇性地定量待測物，而不被正向或負(fù)向的干擾所影響。
方法開發(fā)階段
分析方法的特異性將取決于所使用的抗體或抗體對（antibody pair）的預(yù)先確定的特異性?？贵w可以從商業(yè)來源獲得或內(nèi)部生產(chǎn)。無論哪種情況，在選擇之前都必須評估抗體結(jié)合特性的數(shù)據(jù)，評估分析特異性的方法通常是分析樣本基質(zhì)，樣品基質(zhì)+不同濃度的待測物及其變異體、物理化學(xué)上類似的化合物以及樣品基質(zhì)+可能與待測物共同使用的化合物。
在某些情況下，可以使用一個樣本基質(zhì)來評估特異性，該樣本基質(zhì)包含與體內(nèi)濃度相當(dāng)?shù)囊环N或多種與待測物有關(guān)的化合物。通常，競爭式測試格式比夾心式測試格式更易受干擾物的干擾，因為夾心式分析方法使用兩種抗體，故具有更大的特異性。
如果無法獲得待測物的變異體或相關(guān)形式，則可能無法在方法開發(fā)過程中生成交叉反應(yīng)性（分析特異性assay specificity）數(shù)據(jù)。因此，可能需要對經(jīng)過驗證的分析方法的特異性進(jìn)行回顧性評估，因為隨著時間的流逝，將產(chǎn)生更多有關(guān)待測物行為的數(shù)據(jù)。
在方法開發(fā)過程中，評估選擇性即是評估存在基質(zhì)成分時對待測物的定量。這些基質(zhì)成分可能會干擾抗體與待測物的結(jié)合，應(yīng)當(dāng)在定量下限（LLOQ，即低于低水平QC樣品的濃度）或之上的附近外加待測物到同一樣本基質(zhì)類型的多個批次(至少10個)中，并評估相對誤差的百分比（%RE）。盡管選擇性問題通常在定量范圍的低端發(fā)生，也需要在較高待測物濃度下評估選擇性。在背景干擾與濃度有關(guān)的情況下，必須確定在哪個待測物的濃度之下可能出現(xiàn)干擾。在方法驗證之前，可能需要相應(yīng)地提升最低的定量限。
研究前驗證階段
研究前的驗證過程將證實分析方法的特異性和選擇性性能（使用最相關(guān)的化合物和樣本基質(zhì)）。選擇性由回收率（recovery）代表，回收率的接受標(biāo)準(zhǔn)與準(zhǔn)確性評估相同。推薦的選擇性接受標(biāo)準(zhǔn)是：至少80％被評估的樣本基質(zhì)均獲得可接受的回收率。研究中驗證階段
在樣本分析過程中，通常不存在針對特異性和選擇性的接受標(biāo)準(zhǔn)。如果存在潛在的干擾問題，則必須事先確定樣本的性能特征，并做相應(yīng)的處理。通常情況下，疾病狀態(tài)的樣本基質(zhì)可能包含對照基質(zhì)中不存在的成分，例如，類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor）脫落的可溶性受體，來自自身免疫性疾病的異源干擾、高血脂（lipemic）樣本、溶血（hemolyzed）樣本等。因此，強(qiáng)烈建議在獲得相關(guān)疾病狀態(tài)的樣本基質(zhì)后，重復(fù)進(jìn)行選擇性和特異性實驗。更換抗體批次后，也需要重新驗證特異性和選擇性。本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備，歡迎讀者提供有價值的文獻(xiàn)及其評估。
8. 擴(kuò)展閱讀
袁來如此｜大分子生物分析概論（一）：大分子藥物生物分析的基礎(chǔ)知識
1. V. P. Shah, et al. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence, and pharmacokinetic studies. Pharm. Res. 9:588–592 (1992).2. J. W. A. Findlay, et al. Validation of Immunoassays for bioanalysis: A pharmaceutical industry perspective. J. Pharm. Biomed. Anal. 21:1249–1273 (2000).3. C. M. Riley and T. W. Rosanke. Development of validation of analytical methods: progress in pharmaceutical and biomedical analysis (vol 3) Elsevier (Pergamon), NY 1996.
4. V. P. Shah, K et al. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetics studies. Conference Report. Eur J Drug Metabol Pharmacokinetics 16:249–255 (1991).
5. Guideline on validation of analytical procedures: definitions and terminology International Conference of Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use Geneva 1995 (1996).
6. V. P. Shah, et al. Bioanalytical method validation. A revisit with a decade of progress. Pharm. Res. 17:1551–1557 (2000).
7. K. J. Miller, et al. Workshop on Bioanalytical Methods Validation for Macromolecules: Summary Report. Pharm. Res. 18:1373–1383 (2001).
8. Guidance for the Industry. Bioanalytical Method Validation US Department of Health and Human Services FDA (CDER) and (CVM) May 2001.
9. DeSilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 2003;20:1885–900.
10. J. O. Westgard. Points of care in using statistics in method comparison studies. Clin. Chem. 44:2240–2242 (1998).
11. Watson, RG, et al. Implementing a tiered approach to bioanalytical method validation for large molecule ligand-binding assay methods in pharmacokinetic assessments. Bioanalysis. 2017 9(18):1407-1422
12. D. Rodbard, et al. Kinetics of Two-Site Immunoradiometric (Sandwich) Assays-II. Immunochem. 15:77–82 (1978).
13. B. D. Plikaytis, et al. Determination of parallelism and nonparallelism in bioassay dilution curves. J. Clin. Microbiol. 32: 2441–2447 (1994).
14. C. Hartmann, et al. Reappraisal of hypothesis testing for method validation; Detection of systematic error by comparing the means of two methods or two laboratories. Analytical Chem. 67:4491–4499 (1995).
15. S. R. Searle, et al. Variance Components Chapter 3. John Wiley & Sons, Inc, New York, NY (1992).
16. R. W. Mee. b-expectation and b-content tolerance limits for balanced one-way ANOVA random model. Technometrics 26:251–254 (1984).
