上周，“袁來(lái)如此”專(zhuān)欄就LBA定量方法的監(jiān)管驗(yàn)證展開(kāi)了第一期詳細(xì)介紹，圍繞歷史視角、文件記錄要求、測(cè)試試劑的選擇、穩(wěn)定性、測(cè)試格式和運(yùn)行/批次大?。╞atch/run size)、參照（比）物（REFERENCE MATERIAL)特異性（specificity)和選擇性（selectivity）等方面的內(nèi)容進(jìn)行分享，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，繼續(xù)分享后續(xù)相關(guān)內(nèi)容。
樣本基質(zhì)的選擇、樣本制備和最低稀釋倍數(shù)（MINIMUM REQUIRED DILUTION,MRD）選擇基質(zhì)時(shí)的考慮因素，是小分子開(kāi)發(fā)的分析方法與為大分子藥物開(kāi)發(fā)LBA定量分析方法之間的關(guān)鍵區(qū)別之一。小分子分析方法通常包括一個(gè)分析前的萃取步驟，該樣本前處理步驟通常有助于減輕單個(gè)基質(zhì)的變異性所帶來(lái)的問(wèn)題。
而蛋白待測(cè)物的固有特性使得在樣本分析之前做萃取很難，通常是完全無(wú)法萃取。因此，通常所開(kāi)發(fā)大分子定量方法無(wú)需萃取，即可測(cè)定復(fù)雜生物基質(zhì)中的待測(cè)物。然而，在可能存在內(nèi)源性蛋白待測(cè)物的情況下，必須仔細(xì)地考慮基質(zhì)的選擇和數(shù)據(jù)分析。
方法開(kāi)發(fā)階段
所收集的生物樣品中的待測(cè)物存在于不同的基質(zhì)中，包括血漿、血清、尿液、腦脊液（CSF）、關(guān)節(jié)滑液和均質(zhì)化的組織。由于待測(cè)物的特性會(huì)受到樣本制備方法影響，因此必須在樣本采集過(guò)程中評(píng)估如下因素：所需要的任何添加劑（抗凝劑、蛋白酶抑制劑等）、待測(cè)物的穩(wěn)定性（血漿或血清分離前的全血）、樣本收集后的處理和儲(chǔ)存條件（溫度、瓶型等）。測(cè)試格式、樣本收集條件和其他因素可能會(huì)影響基質(zhì)的選擇，例如如果使用自動(dòng)化樣本處理系統(tǒng)，則血清將是首選的基質(zhì)，因?yàn)檠獫{中通常含有血纖維蛋白凝塊，可能會(huì)干擾移液操作。相比之下，血漿是不穩(wěn)定待測(cè)物的首選基質(zhì)，因?yàn)橹苽溲逅璧臅r(shí)間較長(zhǎng)，而且存在蛋白水解酶（proteolytic enzyme）降解蛋白的問(wèn)題。本文稍后將對(duì)樣本收集后基質(zhì)中的待測(cè)物進(jìn)行更確切的穩(wěn)定性評(píng)估。加標(biāo)樣品（spiked sample）的基質(zhì)應(yīng)當(dāng)與預(yù)期的未知研究樣本的基質(zhì)相同，要使用相同的基質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)/校準(zhǔn)品，standard/calibrator）。當(dāng)在基質(zhì)中檢測(cè)不到內(nèi)源性信號(hào)時(shí)，簡(jiǎn)單地加標(biāo)/回收研究就足以確定合適的空白基質(zhì)。在這些條件下，建議使用標(biāo)稱(chēng)濃度（nominal concentration）。相反，當(dāng)基質(zhì)中存在可定量的內(nèi)源性物質(zhì)，并且內(nèi)源性物質(zhì)和外加待測(cè)物的回收率是累加式（線性）的時(shí)候，可以應(yīng)用一個(gè)校正因子（例如內(nèi)源性濃度4ng/mL，加標(biāo)分析物為6ng/mL，累加效應(yīng)為10ng/mL）。在這種情況下，可將所測(cè)定的內(nèi)源性濃度與所添加的待測(cè)物濃度（標(biāo)稱(chēng)值）相加來(lái)得到指定值（assigned value）（表IIA和表IIB）。表IIA.內(nèi)源性蛋白累加貢獻(xiàn)效應(yīng)的示例。在這種情況下，內(nèi)源性蛋白的影響可以在低質(zhì)量對(duì)照樣品（QC）中觀察到；但其對(duì)中、高水平質(zhì)量對(duì)照樣品的影響不大。
表IIB. 當(dāng)?shù)润w積的基質(zhì)和QC加在一起時(shí)，內(nèi)源性蛋白累加（線性）貢獻(xiàn)的示例。方法：50mL含內(nèi)源性藥物的基質(zhì)（25.7U/L）+ 50mL 標(biāo)準(zhǔn)品10（10U/L）= 期望值17.9U/L（相互以1：2的比例稀釋?zhuān)?2.85U/L+ 5U/L= 17.85U/L）
另一種選擇是減去內(nèi)源性濃度，該濃度是用正在驗(yàn)證的分析方法或一個(gè)正交的（orthogonal）分析方法所測(cè)定的。這種方法需要分析空白樣品（另外加待測(cè)物），這樣就可以減去內(nèi)源量，并計(jì)算出外加的標(biāo)稱(chēng)量。當(dāng)內(nèi)源性濃度和外加的待測(cè)物濃度不是線性關(guān)系時(shí)，就不能用數(shù)學(xué)方法將這兩個(gè)濃度相加，因而只能報(bào)告測(cè)定的（觀察到的）濃度（表IIC）。或者可以在外加待測(cè)物之前，剝離空白基質(zhì)中內(nèi)源性蛋白。
表IIC. 內(nèi)源性蛋白非線性貢獻(xiàn)的例子。觀察到的藥物濃度與“空白”基質(zhì)中的內(nèi)源藥物量或外加的“目標(biāo)”濃度均不是線性相關(guān)。在這種情況下，觀察到（測(cè)定）的濃度是唯一可以放心使用的數(shù)值。
通常不推薦使用剝離了內(nèi)源物的基質(zhì)或替代基質(zhì)，但在無(wú)法設(shè)計(jì)其它策略來(lái)定量?jī)?nèi)源物時(shí)，則是必要的。使用木碳（charcoal）剝離的基質(zhì)，很難保證基質(zhì)的其它方面不發(fā)生變化。如果使用配體親和層析剝離內(nèi)源物，配體的溶出可能會(huì)干擾該分析方法。無(wú)論基質(zhì)干擾的來(lái)源如何，制備QC樣品時(shí)，必須使用與研究樣本類(lèi)型一致的、純粹且未改變的基質(zhì)。除了保證待測(cè)物的穩(wěn)定性外，在純粹基質(zhì)（neat matrix）中制備QC樣品還可用于同時(shí)測(cè)定分析方法的精密度和準(zhǔn)確性。
當(dāng)難以獲得生物基質(zhì)（例如關(guān)節(jié)滑液、腦脊液）時(shí)，可以用一個(gè)替代基質(zhì)（substitute matrix）來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)嘗試使用真實(shí)樣本基質(zhì)制備至少一個(gè)級(jí)別的QC樣品，以證實(shí)基質(zhì)效應(yīng)沒(méi)有影響準(zhǔn)確度，即沒(méi)有均值偏差（mean bias）。分析方法所需的最小稀釋倍數(shù)（MRD）是必須稀釋樣本的最小稀釋倍數(shù)，是為了在分析時(shí)使用規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液，以達(dá)到最優(yōu)的準(zhǔn)確度和精密度。在某些情況下，如當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品是在100%的血清或血漿中制備時(shí)，則不存在MRD，可以直接分析未稀釋的純粹樣本。在其它情況下，如果內(nèi)源性物質(zhì)沒(méi)有產(chǎn)生線性信號(hào)或觀察到的背景信號(hào)不是由于內(nèi)源性的分析物（例如，heterophilic antibodies，風(fēng)濕因子）增加影響的，則可能需要稀釋樣本，以建立可接受的線性關(guān)系。為了克服信噪比的問(wèn)題，所有的樣本都必須以某個(gè)倍數(shù)進(jìn)行最低限度的稀釋?zhuān)匀〉酶叩闹噩F(xiàn)性和準(zhǔn)確度。研究前驗(yàn)證階段
在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中所選擇的生物基質(zhì)將用于制備研究前驗(yàn)證所用的標(biāo)準(zhǔn)品和驗(yàn)證樣品。一旦在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中解決了基質(zhì)的影響，就不需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，但驗(yàn)證報(bào)告中應(yīng)該包括對(duì)該解決方法的討論。如果使用的是經(jīng)過(guò)剝離的基質(zhì)，驗(yàn)證樣品則必須在同樣的基質(zhì)中制備，以評(píng)估精密度和準(zhǔn)確性。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中選擇的MRD也將在研究前驗(yàn)證中得到確認(rèn)。研究中驗(yàn)證階段
在研究中驗(yàn)證時(shí)，除了在觀察到基質(zhì)干擾時(shí)需要額外稀釋樣本外，沒(méi)有與樣本制備相關(guān)的接受標(biāo)準(zhǔn)。由于潛在的基質(zhì)干擾而導(dǎo)致重新分析樣品時(shí)，應(yīng)當(dāng)預(yù)先設(shè)定并常規(guī)地應(yīng)用相關(guān)指導(dǎo)原則。在基質(zhì)批次變化的情況下，應(yīng)當(dāng)制備相同濃度的QC樣品，證實(shí)與研究前驗(yàn)證數(shù)據(jù)的可比性，然后繼續(xù)進(jìn)行樣本分析。標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)物（STANDARD CALIBARTOR)和標(biāo)準(zhǔn)曲線將已知數(shù)量表征良好的標(biāo)準(zhǔn)參照（比）物（待測(cè)物，analyte）加入到適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中制備標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品，在既定的分析條件下生成并得到濃度-響應(yīng)關(guān)系，即標(biāo)（校）準(zhǔn)曲線（standard curve）。根據(jù)這個(gè)標(biāo)（校）準(zhǔn)曲線，未知樣品中分析物的濃度可以通過(guò)內(nèi)插方法計(jì)算。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)建立標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和將一條曲線擬合于校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的回歸模型，此模型需在研究前驗(yàn)證期間得到確認(rèn)，并在分析研究樣本時(shí)使用。表III匯總了評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)和分析回歸模型的建議，將使用表IV中的研究前驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)說(shuō)明統(tǒng)計(jì)分析的過(guò)程。表III. 標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)定標(biāo)準(zhǔn). （未包括“錨定點(diǎn)”）
表IV.一個(gè)研究前驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)曲線響應(yīng)值
方法開(kāi)發(fā)階段
由于標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度在方法驗(yàn)證開(kāi)始后不應(yīng)改變，因此在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)包括更多的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)（standard point）和重復(fù)點(diǎn)（replicates），以便盡早地詳細(xì)研究濃度-響應(yīng)關(guān)系，盡可能地實(shí)現(xiàn)為回歸模型提供可靠的評(píng)估。標(biāo)準(zhǔn)參照（比）物濃度點(diǎn)的范圍應(yīng)包括稀釋后研究樣品的濃度，并在對(duì)數(shù)刻度上近似均勻地間隔。建議至少有10個(gè)非零標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)（復(fù)孔，duplicate）用于濃度-響應(yīng)關(guān)系，用于其早期特征的描述。該濃度-響應(yīng)關(guān)系可以使用4/5參數(shù)的logistic函數(shù)（4/5PL 模型）來(lái)描述。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)擬合校準(zhǔn)濃度點(diǎn)的平均響應(yīng)值（圖1A）。圖1. A.5參數(shù)logistic (5PL)加權(quán)非線性最小二乘法回歸擬合的曲線。平均響應(yīng)是表IV.中列出了第6個(gè)運(yùn)行（batch）的重復(fù)結(jié)果。B.圖1A中回算標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度的百分比相對(duì)誤差。所有數(shù)值都在標(biāo)稱(chēng)值的10%以?xún)?nèi)。
擬合曲線時(shí)，對(duì)平均響應(yīng)值是否加權(quán)的問(wèn)題，應(yīng)通過(guò)對(duì)復(fù)孔數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)方差與不同濃度點(diǎn)的平均值之間的關(guān)系來(lái)評(píng)估決定。例如，表IV中標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)方差與平均響應(yīng)的關(guān)系圖在對(duì)數(shù)刻度上顯示了一個(gè)線性增加的關(guān)系（圖2）。在這種情況下，加權(quán)擬合通常比不加權(quán)更合適。在考慮刪除復(fù)孔值的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，有關(guān)復(fù)孔值變異性的信息會(huì)非常有用。
表IV.一個(gè)研究前驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)曲線響應(yīng)值
圖2. 表IV所列標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值的混合運(yùn)行（batch）內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方差與累積平均響應(yīng)之間的關(guān)系。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)濃度點(diǎn)的平均值和通過(guò)方差分析（ANOVA）計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)方差。在高吸光度水平下，變異性較大；這表明，在擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，加權(quán)可能是適當(dāng)?shù)摹?/span>
在建立校準(zhǔn)模型時(shí)，建議分析至少3個(gè)獨(dú)立運(yùn)行（batch/run）的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度-響應(yīng)數(shù)據(jù)，每次運(yùn)行應(yīng)包含兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便評(píng)估運(yùn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的可重復(fù)性。模型的適宜性取決于標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)回算濃度的RE，計(jì)算一個(gè)濃度點(diǎn)的RE如下：從回算濃度中減去標(biāo)稱(chēng)濃度并將其差值除以標(biāo)稱(chēng)濃度。通常，對(duì)于曲線內(nèi)的大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)回算濃度的絕對(duì)RE應(yīng)為20%。例如，根據(jù)加權(quán)5PL回歸曲線擬合平均光吸收值（表IV中第6個(gè)運(yùn)行的數(shù)據(jù)）所得出的模型，回算濃度的絕對(duì)REs都是<10%（表V和圖1B）。同樣，其他5個(gè)運(yùn)行的絕對(duì)REs也始終一致地<10%（第1個(gè)運(yùn)行中的幾個(gè)點(diǎn)除外）。
表 V. 對(duì)于表IV中數(shù)據(jù)的平均響應(yīng)，回算的標(biāo)準(zhǔn)濃度的百分比相對(duì)誤差 (%RE)
一個(gè)可被接受的校準(zhǔn)模型，其曲線的累積回算數(shù)值對(duì)于在預(yù)期的定量范圍內(nèi)的所有濃度，應(yīng)具有10%的絕對(duì)平均RE值和15%的變異系數(shù)（CV）（參見(jiàn)表V）。在校準(zhǔn)品濃度范圍中，如果平均RE存在一個(gè)趨勢(shì)，即回算濃度始終一致地高于或低于標(biāo)稱(chēng)濃度，則是擬合失敗的證據(jù)，會(huì)使該模型失效。擬合失敗可能是由于選擇了不合適的平均值函數(shù)（例如，在濃度-響應(yīng)曲線不對(duì)稱(chēng)時(shí)使用了4PL函數(shù)）或加權(quán)過(guò)程不當(dāng)。例如，加權(quán)使得擬合的曲線與表IV中的數(shù)據(jù)更相符，其證據(jù)是：在較低濃度部分，降低了平均RE(圖3A)和CV(圖3B)；而在較高濃度部分，準(zhǔn)確性或精密度的損失極小。圖3. A.未加權(quán)和加權(quán)五參數(shù)logistic(5PL)回歸曲線回算濃度的累積平均相對(duì)誤差百分比的比較與表IV的吸光度數(shù)據(jù)相吻合。加權(quán)模型的結(jié)果在整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍是可以接受的，而非加權(quán)模型在低于1000pg/mL濃度是不可接受的。B.未加權(quán)和加權(quán)五參數(shù)logistic (5PL)回歸曲線回算濃度變化的累積百分比系數(shù)的比較與表IV的吸光度數(shù)據(jù)相吻合。加權(quán)回歸模型的計(jì)算值總結(jié)如下在表V中。加權(quán)模型在較低濃度水平下得到了較小的批間變化系數(shù)。
表IV.一個(gè)研究前驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)曲線響應(yīng)值
表 V. 對(duì)于表IV中數(shù)據(jù)的平均響應(yīng)，回算的標(biāo)準(zhǔn)濃度的百分比相對(duì)誤差 (%RE)
研究前驗(yàn)證階段
對(duì)研究前驗(yàn)證所需的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品，應(yīng)根據(jù)方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中獲得的性能信息來(lái)制備。通常，對(duì)于使用4/5PL函數(shù)來(lái)擬合的濃度-響應(yīng)關(guān)系，在預(yù)期的濃度范圍內(nèi)，應(yīng)至少包括6個(gè)非零、復(fù)孔校準(zhǔn)點(diǎn)，這些校準(zhǔn)點(diǎn)應(yīng)在對(duì)數(shù)刻度上近似均勻地間隔。為了改善曲線擬合，可以包括定量范圍之外的錨定點(diǎn)或校準(zhǔn)點(diǎn)。
在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中建立的回歸模型應(yīng)在至少6個(gè)獨(dú)立的研究前驗(yàn)證運(yùn)行中得到確認(rèn)，通常也在相同的運(yùn)行中評(píng)估方法的精密度和準(zhǔn)確度。在一個(gè)運(yùn)行中接受標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，回算濃度值（至少為75%，不包括錨定點(diǎn)和校準(zhǔn)點(diǎn)）的%RE應(yīng)在標(biāo)稱(chēng)濃度的20% 以?xún)?nèi)（對(duì)于LLOQ，%RE應(yīng)在25%以?xún)?nèi)）。驗(yàn)證結(jié)束時(shí)，應(yīng)為每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)計(jì)算所有運(yùn)行的累計(jì)平均%RE和%CV，如果每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)（不包括錨定點(diǎn)）的RE和CV均為15%，則回歸模型是可以接受的；在LLOQ，%RE和%CV應(yīng)為20%。應(yīng)當(dāng)在報(bào)告驗(yàn)證樣品的分析結(jié)果之前確認(rèn)回歸模型。由于可確定的原因造成了技術(shù)誤差（如，移液誤差），或可通過(guò)應(yīng)用a priori統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)編輯標(biāo)準(zhǔn)曲線，屏蔽某些校準(zhǔn)點(diǎn)。
研究中驗(yàn)證階段
對(duì)每個(gè)研究中的測(cè)試運(yùn)行，應(yīng)使用與研究前驗(yàn)證相同的標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和編輯標(biāo)準(zhǔn)曲線中某個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的編輯必須獨(dú)立于QC，并于評(píng)估QC樣品的性能之前完成。編輯后剩余的校準(zhǔn)點(diǎn)的最終數(shù)量必須≥總校準(zhǔn)點(diǎn)的75%；或者除錨定點(diǎn)外，至少有6個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)。如果刪除高（ULOQ）或低校準(zhǔn)點(diǎn)（LLOQ）中的任何一個(gè)，這個(gè)運(yùn)行的定量范圍將被限制在下一個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，所以，必須重新分析超出定量范圍的樣本。本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開(kāi)渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備，歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
